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Diagnóstico del Metapneumovirus Aviar - Determinación del antígeno
Los siguientes métodos pueden ser utilizados para la identificación del virus:
- Aislamiento viral
- Prueba de Inmunofluorescencia
- Prueba de Inmunohistoqumica
- Microscopia electrnica
- RT-PCR y RFLP
El diagnóstico laboratorial también puede llevarse a cabo por medio de la serologa
determinando la presencia de anticuerpos.
Aislamiento viral
El aislamiento viral se debe intentar realizar nada más aparecer los primeros signos clínicos de enfermedad ya que el MPV se localiza, tanto en pavos como en pollos/gallinas, por un corto período de tiempo tras la infección.
El uso de aves centinelas o la aplicación del material recogido en aves SPF pueden ser de gran ayuda en este aspecto.
El aislamiento viral puede hacerse en:
- Huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) inoculados en el saco vitelino.
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Cultivo en anillos traqueales
- Diferentes cultivos celulares (por ejemplo de fibroblastos de embrión de pollo). El aislamiento de los subtipos A y B de material de campo no puede ser hecho en cultivos celulares, para esto deben usarse cultivos de anillos traqueales o la inoculación de embriones en el saco vitelino. En los Estados Unidos se señala el uso de cultivos celulares para el aislamiento del subtipo C, pero normalmente el material de campo lleva previamente, por lo menos, 2 pases en saco vitelino antes de ser inoculado en los diferentes cultivos celulares.
El virus causa hemorragias en los embriones y algo de mortalidad; los fluidos del huevo pueden ser inoculados en cultivos celulares (VERO, FEP) en donde se observará el efecto citopático, generalmente tras llevar varios pases ciegos. Una vez aislado el virus puede ser adaptado a una variedad de cultivos celulares (por ejemplo VERO, FEP, etc.). Cuando se trabaja con cultivo de anillos traqueales debe recordarse que el subtipo C no es ciliostático y por tanto no es posible usar este método para el aislamiento de este subtipo de material de campo.
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Gráfico 1: El MPV puede ser aislado durante un periodo corto tras la infección. Una vez que los lotes muestras signos clínicos de enfermedad el virus ya no puede ser aislado
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Prueba de inmunofluorescencia
Conjugado de anticuerpos y fluorescena, al cual se adhiere el MPV en los preparados traqueales en caso de que el virus se encuentre presente. El mtodo de tincin conocido como inmunohistoqumica permite el reconocimiento del virus en los diferentes tejidos y rganos.
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Inmunohistoqumica
Método de tinción que permite el reconocimiento del virus en los órganos
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Microscopa electrnica
Reconoce la morfología del virus
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RT-PCR y RFLP
La RT-PCR (del inglés: real time polymerase chain reaction = reacción en cadena con polimerasa en tiempo real) y RFLP (del inglés: restrictive fragment length polymerase = análisis del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) se utilizan recientemente con frecuencia para detectar y diferenciar entre cepas del virus. La técnica se basa en la determinación y la comparación de los fragmentos de nucleótidos de ciertos genes del virus. Los “primers” se seleccionan de manera que reconozcan a todos los tipos conocidos del virus o específicamente los diferentes tipos. La obtención de los resultados es muy rápida, pero tiene algunos inconvenientes, como son: la sensibilidad del proceso, la posibilidad de contaminaciones de DNA de anteriores pruebas y que se pueden necesitar RT-PCR específicos para los diferentes subtipos y de esta forma diferenciar la presencia de todos los subtipos existentes del virus.
Esta tecnología también puede ser utilizada para evaluar la presencia de los diferentes subtipos del MPV en el campo.
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